南京大學研究院發現納米孔道內離子流傳感信號的來源

納米孔單分子檢測技術于30年前被提出并得到快速的發展，基于納米孔的DNA測序商品儀器已問世多年。目前，研究人員正拓展該技術用于蛋白質/多肽識別、miRNA檢測、酶活性鑒定、分子構象識別等領域。生物納米孔就是一個由氨基酸有序排列組成的蛋白質分子的納米孔道，目標分子進入納米孔道時將誘導時序性的離子流變化，從而獲取孔道內部單個分子的信息，因此，孔道內的離子流變化是納米孔道傳感的基礎與核心，并實質上決定了納米孔道的傳感靈敏度及其應用范圍。待測分子誘導的離子流阻斷通常被認為主要由其在納米孔道內排開溶液體積造成，然而，實驗中頻繁出現的離子流阻斷與排阻體積的不一致性時常困擾著研究者;同時，現有的對孔道內離子流阻斷的這一理解也限制了該技術在單分子蛋白質測序、復雜體系中生物標志物識別中的應用和發展。因此，對納米孔道內離子流傳感信號重新從電化學源頭認識至關重要。

圖1. 相互作用決定單個甲基差異誘導Aerolysin納米孔道內離子流阻斷增強

近日，南京大學研究院生命分析化學國家重點實驗室龍億濤課題組重新審視并提出了納米孔道內離子流傳感的來源：待測物在孔道內的排阻體積與其和孔道之間的相互作用協同決定了離子流信號的特征。該工作首先從理論角度揭示了納米孔道與目標分子之間的非共價相互作用，包括靜電相互作用、范德華相互作用、氫鍵等通過影響孔道內的離子遷移率，從而改變孔道內未被目標分子占位部分的溶液電導，以乘積的形式在體積排阻的基礎上誘導離子流傳感信號的增強。同時，在實驗驗證方面，基于單個甲基差異的DNA片段在Aerolysin生物納米孔道中誘導的增強的離子流信號，結合溶液電導理論和納米孔道實驗，證實了甲基化DNA與Aerolysin的相互作用在增強離子流信號中的重要性，并對其在離子流信號增強中的貢獻進行了定量化。

圖2. 分子動力學模擬揭示相互作用差異

通過分子動力學模擬，進一步揭示了Aerolysin識別甲基化DNA/正常DNA的主要區域，證明了其與甲基化DNA/正常DNA差異的相互作用，并通過具體解析孔道內各個氨基酸位點與DNA的各種非共價相互作用，提出了Aerolysin基于相互作用識別DNA上單個甲基基團的機制。同時，通過巧妙設計Aerolysin上的突變以定向調控非共價相互作用類型及大小，證實了非共價相互作用協同體積排阻對離子流信號的”倍增”效應。

圖3. 定向設計特定氨基酸相互作用調控識別能力

該研究成果以“Revisiting the Origin of Nanopore Current Blockage for Volume Difference Sensing at the Atomic Level”為題，發表于JACS Au(DOI：10.1021/jacsau.1c00109，文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.1c00109), 南京大學化學和生物醫藥創新研究院的博士后李孟寅為論文第一作者，龍億濤教授為通訊作者。此項研究得到了國家自然科學基金重大項目“基于納米孔道電荷傳輸的單分子單細胞精準測量”和中國博士后科學基金等經費資助。